LB-MES培养基:LB培养基,加10mMMES,调pH值至5.6。
1MMgCl2:称取20.33gMgCl2?6H2O,溶于mL蒸馏水中。
mM乙酰丁香酮:称取0.02g乙酰丁香酮溶于1mLDMSO。
操作步骤:
1.活化菌株。新鲜转化的菌则不需活化。除了需转化的目的菌株之外,同时还需准备携带病毒转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)抑制子P19的菌株。
2.分别挑取目的菌株和P19菌株的单克隆摇菌,28℃,rpm,培养过夜。
3.取10μL的过夜培养物转接到5mLLB-MES培养基中,并加入2μLmM乙酰丁香酮。28℃,rpm,培养16h。
4.当OD达到1左右时,收集菌体,用10mMMgCl2重悬菌体。将目的菌株用10mMMgCl2重悬至OD为1.0,P19菌株重悬至OD值为0.7。并将两种菌液等体积混合。
5.按1﹕的比例,将乙酰丁香酮加入到混好的菌液中,室温避光静置3h。
6.注射烟草:
1)叶片的选择:选择生长状态好,叶面平整的叶子。前面四片叶子(包括子叶)一般表达不好,不能用于注射。
2)注射时用1mL注射器,去掉针头,抵住叶子背面,轻轻将菌液推入。
7.转化3天后检测结果。
说明:
如需共转多种质粒,可将菌液OD调整为1.0后按比例混合即可。
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